山東譜析分享:色譜柱的“退休”標準
色譜工作者常會碰到這樣的問題,什么時候該換色譜柱了? 色譜柱的塔板數能體現色譜柱的狀態嗎?確定表明一支色譜柱應該“退休”的標準,從經驗來看,當一支色譜柱的塔板數降低到新柱子時的百分之多少時就可以認為該色譜柱不能再使用了呢?將塔板數作為評價色譜柱質量的唯一指標合適嗎?在您的實驗室里是如何判斷一根液相色譜柱不可以再用了呢? 三種現象暗示色譜柱該“退休” 色譜柱是用在色譜儀分離試驗中將多組分樣品分離為單個組分的儀器,它是色譜分離系統的核心。色譜柱分為填充柱和毛細管柱兩類,具有柱效高、選擇性好,分析速度快等特點。 色譜柱進行長期的分離檢測操作之后,可能會出現檢測速度下降的現象,那么碰到這樣的問題,是否就該考慮更換色譜柱了呢?
檢測色譜柱分離效率主要看三個參數:理論塔板數、分辨率、峰形。 理論塔板數是用于定量表示色譜柱的分離效率參數之一(簡稱柱效)
柱效取決于固定相的種類、色譜的柱效性質(粒度、粒徑分布等)、填充狀況、柱長、流動相的種類和流速及測定柱效所用物質的性質。塔板數是一個粗略的指標,不能作為評價色譜柱的標準。通常使用塔板數來考察色譜系統:將新柱子接到儀器上,根據色譜柱生產商提供的測試條件測試該色譜柱,你應該得到和分析報告上同樣的結果。最差也應該得到比報告值低10%的塔板數。如果你所測得的塔板數遠遠低于廠家提供的報告數據,這就說明你的色譜系統可能存在一些問題。進樣器、柱外效應、毛細連接以及檢測器都是容易出現問題的地方。 分辨率是我們考察色譜柱的一個非常重要的指標,只要兩個組分可以獲得基線分離,對該分析物的定量就不會有什么問題。對于對稱的高斯峰來講,1.5的分辨率即可得到基線分離;若Rs在1.7至2.0之間則更好。若峰拖尾嚴重則需要更高的分辨率。使用分辨率作為色譜柱的評價指標的好處在于我們可以直觀地看到相鄰的峰的分離情況。 另外一個考察色譜柱質量的標準是峰形拖尾情況,廠家測試報告的峰形都非常漂亮,但這并不代表該色譜柱分析實際樣品的情況。實際樣品中總是含有或多或少引起峰形拖尾的組分。最值得一提的是含有氮原子的化合物,這些化合物和硅膠骨架上的游離硅羥基結合非常緊密,隨著色譜柱使用時間越長,鍵合相流失,拖尾則更加嚴重。然而拖尾情況的改變不像分辨率的改變那樣能夠馬上看出來。基于此,最好定一個拖尾因子的上限,如美國藥典規定拖尾因子不超過1.8。 較好的方法是使用壓力、分辨率和峰形的混合指標來考察一根色譜柱的狀態。壓力的測量是最容易的,通常我們確定的色譜方法要滿足以下的要求:用新柱子時柱壓不高于2500psi,在任何情況下壓力都不超過3000psi。盡管現代的液相色譜儀系統都可在更高的壓力下使用,但由于高壓產生的系統損耗和泄漏的問題會很嚴重。當壓力超過3000psi時,考慮更換進樣器和色譜柱之間的0.5mm孔徑的在線濾片。如果更換濾片后壓力仍然高,則色譜柱的濾片或者是色譜柱已經被污染,這提示我們該換柱子了。
有統計表明,超過60%的色譜柱損壞是由于壓力過高的原因。 我們的經驗是,在日常使用氣相色譜儀或者液相色譜儀進行分離實驗時,根據樣品的使用要求,通過分析足夠多的實際樣品,了解色譜柱分離效果變差的時候是什么樣的情況,從而確定色譜柱“退休”標準。